脑血管疾病干细胞生物学治疗前景

　脑血管疾病是指由于各种脑血管病弯引起的脑部病弯，其中以脑卒中为主，脑卒中的发病率、患病率和死亡率随年龄的增长而增长。由于病因、发病机制复杂，所采取的干预措施如脑梗塞的早期溶栓和脑出血的早期微创血肿清除等，仍存在着相当的局限性，使脑卒中的治疗状况得到根本改善的相关研究仍待进一步深入。随着人们对神经系统再生与干细胞的认识逐渐加深，干细胞移植在某些神经系统变性疾病实验与临床治疗中的部分的成功的线索，干细胞移植也可能为脑卒中的治疗开辟了崭新的领域。

神经干细胞与脑血管疾病的治疗

　　1.神经干细胞定义：神经干细胞是指具有分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能够自我更新并能够大量神经组织细胞的细胞。它具有多种分化潜能和自我更新能力。

　　2.神经干细胞的分布、发育与分化：它们不仅存在于发育的哺乳动物神经系统中，而且还存在于成年哺乳动物神经系统内。其中，侧脑室附近的室管膜下区、海马和齿状加是目前公认的成年哺乳动物神经系统中神经干细胞最为集中的部位。神经干细胞的发育和分化取决于特定的基因在特定的部位和时间表达，同时受到神经营养因子和内环境的共同调控。从神经干细胞到终末细胞要经过两个阶段：首先NSC增殖分裂成相对未分化的祖细胞；然后进一步分化成熟，形成终末细胞。早在20世纪90年代初期就有研究者发现CGFr干细胞能产生两种神经祖细胞-神经元祖细胞和胶质细胞祖细胞，然后在神经营养因子的作用下进一步分化，最终形成神经系统的各类细胞（小胶质细胞除外）。

　　3.脑卒中时内源性神经干细胞的激活

神经干细胞在神经营养因子和内环境的调控下可分化成某些类型的神经细胞，对因缺血损伤而造成的神经功能丧失可能具有代偿和修复作用。那么有关脑缺血对神经干细胞的增殖和分化的影响如何？动物在脑缺血后功能出现自身改善，临床上的病人在脑缺血后功能可部分或完全恢复，这其中有神经干细胞的作用如何？学者们对此进行了深入研究。

短暂结扎成年沙土鼠双侧CCA10分钟，可发现齿状加新分裂细胞从颗粒下带迁移至颗粒细胞层，并发育成熟为神经元。新生细胞呈现神经元表型的最早时间是缺血后26天，存活至少7个月，部位仅为颗粒细胞层。在缺血后的2～5周，大部分新细胞保持在分化但不是完全成熟状态。阴断大鼠MCA90分钟，双侧半球的颗粒下层和室下带的增殖细胞都增加，以缺血侧的颗粒下层更显著。这些增殖细胞同时表达了未成熟神经元的标志物doublecortin和增殖细胞核抗原（PCNA），但没有表达更成熟神经元标志物NeuN，提示增殖细胞是新生神经元。

上述工作表明齿状加的神经干细胞通过颗粒下带的增殖对缺血损伤作出反应。神经元和胶质祖细胞起源于颗粒细胞层和齿状回门部的干细胞，颗粒细胞的苔藓纤维里神经细胞粘附分子多聚唾液酸的高表达对干细胞的迁移可能起重要作用，提示神经干细胞具有使神经元网络在脑缺血后恢复和重新分布的潜力。神经干细胞修复损伤的机制可能是：（1）在宿主和干细胞分化成的神经元之间形成突触中继，通过突触中继这种“神经元桥”的形成使轴突“主动”再生；（2）为轴突生长提供基质；（3）分泌必需的营养因子；（4）帮助无髓或新生轴突形成髓鞘。

　　4.神经干细胞移植治疗脑血管病的理论基础：

      ①低免疫源性：神经干细胞是未分化的原始细胞，不表达成熟的细胞抗原，具有低免疫源性，因此在移植后相对较少发生异体排斥反应。

      ②自我更新：克隆化的神经干细胞系，在无血清条件培养下，或经癌基因转染后，可在体外传代达三年以上。但经癌基因转染的神经干细胞在移植入体内后，其基因表达在48小时后自动下调，因此未发现肿瘤形成的现象。

③多潜能分化：神经干细胞具有向神经元和胶质细胞分化的能力。体外培养发现，分化环境中的细胞因子对神经细胞的分化起到调节作用，因此可以在一定程度上控制其分化的时间和方向。随着对跨胚胎层分化调控机制的深入认识和争论，神经干细胞的移植将更加丰富。

　　④良好的组织融合性：脑室内移植的神经干细胞可以通过血脑屏障，迁徙致脑实质中与宿主细胞在形态和功能上形成良好的整合。神经干细胞与宿主神经组织的良好的融合性，确保了神经干细胞的长存活，并真正达到功能修复的能力。

　　⑤迁徙能力：神经干细胞具有迁徙能力，这使得在脑血管病的治疗中，可以将神经干细胞移植到损伤区边缘，一方面可以避免移植物因缺血损伤后毒物的影响而死亡，另一方面，神经干细胞在迁徙的过程中，又参与了神经功能和结构的修复。

　　⑥长期存活：神经干细胞具有的低免疫性，良好的融合能力，迁徙能力决定了神经干细胞在移植后可能长期存活。若为从自身组织中获得的NSC，长期戚可能性则更明显。

　　5.神经干细胞治疗脑血管疾病的实验进展：

　　目前神经干细胞已经得到成功分离、纯化和传代，动物实验证明神经干细胞移植可以在一定程度上修复脑缺血损伤。小鼠出生后脑室注射外源性神经干细胞，7天后绐予缺血损伤可诱导外源神经干细胞-过性增殖，2～5周后可见NSCs集中分布在梗死腔周围，并在半暗区发现外源神经干细胞分化的神经元和少突胶质细胞增多。Veizovic 等发现，60分钟MCAO两周后，MPH36神经干细胞系移植到缺血侧纹状体和皮质8个位点，接受移植的动物在18周内，其感觉运动障碍恢复至假手术组相同水平；而移植到缺血对侧，可见神经干细胞向缺血侧的迁移，且显著减小梗死体积。Sinden等也发现成年大鼠全脑缺血15分钟产生的功能障碍可被MHP36细胞系抑制消除。该干细胞系还可有效地治疗脑缺血后NMDA介导的兴奋毒性海马CA1损伤产生的认知功能障碍。

　国内安沂华等报道大鼠胚胎神经干细胞移植治疗脑出血的实验研究中证实移植后的干细胞在脑内具有向损伤区域迁徙和多向化能力，移植四周后，BrdU染色可见移植到损伤对侧尾状核内的干细胞向损伤侧迁徙，该细胞群中大量细胞为GFAP染色阳性的星形胶质细胞，未发现tubrlin-β阳性的神经元细胞。移植到血肿侧的干细胞环绕血肿灶排列，镜下可见大量的GFAP阳性的星形胶质细胞，周边可见少量tubrlin-β染色阳性的神经元和GalC染色阳性的少突胶质细胞。

　吴洪亮等的从新生大鼠脑室下区分离并鉴定神经干细胞，经培养扩增后，用Brdu标记培养增殖的神经干细胞，将其移植入经Ⅶ型胶原酶尾状核注射造脑出血模型的大鼠的脑出血同侧的侧脑室中。一天后，可见细胞多在脑室周边；七天后脑室下区可见零星存在的移植细胞。还在进一步探讨移植细胞对病变老鼠的功能和脑部结构的长期影响。

　6.存在的问题：

　神经干细胞虽然能迁徙入受损区，并分化成神经细胞和胶质细胞，介目前仍然无证据表明移植的神经干细胞与宿主细胞建立了真正的突触联系。参与了宿主的神经网络的形成。并且，神经干细胞增殖.分化.迁徙及与组织结构融合的细胞内环境的调控机制仍不清楚，对移植后神经干细胞迁徙速度，分化方向，尚缺乏有效的调控手段，使移植治疗的效果受到一定的限制。干细胞移植后的功能性分化研究有待于深入。

　间充质干细胞与脑血管病的治疗

　1.间充质干细胞的定义：

　间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs)是中胚层来源的具有多向分化能力的干细胞，主要存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，胎儿脐血中亦可分离得到。具有向骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、肌细胞、神经细胞、干细胞、脂肪细胞和造血支持间质细胞等分化的能力。同所有的干细胞一样，骨髓间充质干细胞也具有自我更新能力和多向分化潜能。它虽然仅占骨髓单核细胞的0.001% ～0.01%,但是却具有惊人的增殖能力。对MSCs具有强大的自我更新能力。

　　2.间充质干细胞的分化潜能

　多向分化性

　骨髓间充质干细胞来源于中胚层，在一定诱导条件下具有向成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、肌腱细胞、脂肪细胞以及基质细胞等中胚层细胞分化的能力；同时，MSCs还可以向外胚层的神经元细胞和内胚层的肝卵圆性细胞分化。这似乎突破了MSCs仅为中胚层干细胞的概念，展示了MSCs在神经系统疾病的治疗上也具有重要的理论研究意义和广阔的应用前景这方面存在很大的争议及可探索的前景。

　向神经细胞定向分化

　体内分化试验

　　1999年Kopen等首次报道将MSCs注入新生鼠侧脑室后可分化为神经元和神经胶质细胞，并具有一定的迁移能力。随后，Science杂志又报道两个不同的研究小组通过不同的方法观察到外源性MSCs可在小鼠的脑内转变为神经元，表达神经特异核蛋白（NeuN)，NF等神经元标志蛋白。这些发现是轰动性的，人们长久以来认为只有外胚层的细胞才可以分化成神经细胞，那么中胚层来源的间充质干细胞怎么能够跨越胚层分化呢？是我们将间充质干细胞定义为中胚层细胞有误，还是间充质干细胞中存在一些更原始的干细胞（例如MAPC），或是生物体内原本就存在跨胚层的黄向分化现象？科学家们围绕着这个问题进行了旷日持久的争论。2002年8月Science杂志以简报的形式报道了Castro等体内分化实验的阴性结果，Castro 认为前述体内分化试验的阳性结果是由实验设计的不合理造成的，一石激起千层浪，更多的科学家卷入了MSCs向神经细胞分化能力的讨论中。

　2003年2月NIH的Mezey等在Science杂志发表文章指出Castro的实验设计存在缺陷。同时Mezey及其同事对四名女性病人进行尸体解剖，并检查了这些病人的脑组织。这四名女性患者都曾接受来自男性供体的骨髓移植，用以医治疗白血病或其他非神经性疾病，其中两名儿童，两名成人。四名患者在骨髓移植后存活了1-9个月。研究者在这些病人的脑组织中寻找男性细胞-含有Y染色体的细胞。因为患者均为女性，自体细胞不会含有Y染色体，故Y染色体可以作为区别来源于供体的细胞和患者自体细胞的标记。研究者在4名患者的脑组织中均发现了含有Y染色体的神经元，表明这些神经元是由移植的骨髓中的细胞产生的。这些新的神经元大多位于大脑皮质和海马回，没有出现细胞融合现象，是正常核型的细胞。所有患者脑组织中含有Y染色体的细胞都是成簇出现，而非在整个脑组织中随机出现。而有的细胞簇同时含有神经元和非神经细胞。这说明细胞簇可能是单个来自骨髓的细胞移行到“需要”的脑组织部位，然后分化成为其他类型的细胞，也可能是由许多骨髓细胞被同时“召集”到特定部位而形成的。已知骨髓细胞中至少有两种类型蝗干细胞：造血干细胞和间充质干细胞，目前还无法确认是哪种干细胞分化成了神经元。

　体外分化试验

　许多研究小组在体外培养的条件下进行了间充干细胞的体外分化实验。Woodbury等用心β巯基乙醇（BME）、二甲基亚砜（DMSO）和丁羟基茴香醚（BHA）等一些具有还原性的物质成功诱导了MSCs转变为神经元，并表达神经元特有的标记物。Sanchez Ramos等将MSCs诱导为神经元样细胞的诱导因子改为表皮生长因子（EGF）或脑源性神经生长因子（BDNF）与视黄酸（RA）的组合。Deng等联合应用异丁甲基黄嘌呤（IBMX）和二丁基环磷酸腺苷（dbcAMP)提高胞内cAMP的含量，亦将MSCas转变为神经元样细胞。

　张化彪等的系列研究提示所培养细胞经流式细胞仪检测CD90、CD106呈阳性而CD45呈阴性，初步证实是MSCs，流式细胞仪检测显示细胞均一性达95%以上，说明细胞一性较高，可以满足组织工程的需要；体外诱导分化结果显示诱导后的细胞NeuN 、GFAP 、CNP三者皆呈阳性，表明MSCs在体外可以分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞样细胞。同时，有Nestin 阳性细胞的出现，表明在MSCs转化为了NSCs；免疫追踪技术发现MSCs的迁移主要集中在患侧出血周围、海马区、胼胝体以及大脑皮质的其它部位，同时在健侧也有少量的分布，荧光双标发现，MSCs在脑出血大鼠脑内分化为NeuN和GFAP阳性的神经元和星型胶质细胞，其中在海马处的MSCs大部分分化为神经元，在出血灶周围的MSCs大部分分化为星型胶质细胞；爬行计分结果可见，颈动脉组和侧脑室组的大鼠治疗作用明显。其中侧脑组效果最好，颈动脉次之，颈静脉几乎没有疗效。

　　2.间充质干细胞治疗脑血管病理论基础

　 ①易获得性②体外培养能快速扩增③可自体移植，能免疫耐受④能够与宿主大脑整合并长期存活⑤能够转染和长期表达外源性基因⑥有证据表明MSCs能够穿越血脑屏障，促进R小胶质细胞的形成⑦在脑的微环境中存在一些因素如神经生长因子（NGF）等有保护MSCs在脑中不被破坏，促进其增殖分化的作用。

　3.间充质干细胞治疗脑血管病的实验进展

　骨髓间质干细胞具有高度的自我更新能力和可能的多向分化潜能，这使它成为细胞治疗的一种合适的候选细胞。MSC比其他干细胞优越的地方在于：MSC从骨髓中获得，这就是克服了从大脑获取神经干细胞带来的危险，取材容易，对健康无害；而且自体移植克服了由应用胎生组织带来的伦理及免疫反应等问题。

　科学家们已经在间充质干细胞移植治疗大鼠脑梗塞方面做了很多工作。Li等首先建立大鼠MCAo模型，4天后在麻醉状态下纹状体内注射MSCs，28天后处死动物，发现供体的MSCs在脑内存活，并迁移到距注射击部位2.2mm处。其中有1%的细胞表达NeuN,8%的细胞表达GFAP，表明MSCs在体内已分化为神经元和胶质细胞，实验组的神经功能恢复情况明显好于对照组。Chen等在鼠发生2小时MCAo后，将MSCs经静脉途径输入体内，发现输入MSCs的实验组神经功能恢复指标（如躯体感觉，NSS计分）都好于对照组。MSCs聚集在缺血半球的同侧，其中一些细胞已表达神经元特有的标记物。此外脑室内注射MSCs入MCAo模型和通过颈总动脉内灌注MSCs来治疗发生MCAo的脑缺血模型，结果均证实这些途径对MSCs治疗脑缺血亦有效。

　褚倩等人以自体间充质干细胞移植治疗大鼠脑缺血模型，已分离培养Wistar大鼠自体间充质干细胞24株，原代培养的间充质干细胞12-30在可达到融合状态，约7-10天可传一代，传代后细胞增殖状况良好。用BME和BHA进行体外诱导分化，可见部分间充质干细胞表达神经胶质细胞的特异性标记物GFAP，部分间充质干细胞表达神经元的特异性标记物NeuN,统计学分析正在进行中。截肢后已进行自体间充质干细胞培养的Wistar大鼠，在MCAO后当天用立体定向术将绿色荧光蛋白标记的干细胞注入梗塞侧的侧脑室中，移植后一周可见移植树的细胞进入梗塞灶周边，并分化成GFAP阳性细胞，其行为学评分优于对照组。2周、4周、8周的长期观测尚在进行中。

　张化彪、张苏明等人的研究证明：将标记后的MSCs通过颈动脉、颈静脉、侧脑室三种途径植入脑出血大鼠体内，颈动脉组和侧脑室组的移植治疗起了明显的效果，神经功能障碍有明显改善，与模型级和颈静脉组有显著性差异。同时发现，MSCs的迁移主要集中在患侧出血周围、海马区、胼胝体以及大脑皮质的其它部位等，可能是由于这些部位的继发性脑缺血损伤比较严重，进而产生一种使MSCs迁移的趋化因子，导致了MSCs的移行。

　4.间充质干细胞移植治疗脑血管疾病存在问题

　目前尚无病人自体间充质干细胞移植治疗脑缺血、脑出血的报道。原因：①如果是自体移植，从分离、分化、培养传代到移植约2-4周左右，超过了动物实验中小于1周时间移植的报道；②从脑血管病进行干细胞移植机制上看，应于早期小于1周干预好③间充质干细胞移植脑内后的分化、迁徙与周围组织相融合的调控机制尚不清楚。

　胚胎干细胞与脑血管疾病的治疗

　1.胚胎干细胞定义：胚胎干细胞（ES细胞）是从着床前囊胚内蒙古细胞团（ICM）或早期胚胎原始生殖细胞（PGCs）分离克隆出来的一类未分化的全能性（多能性）干细胞。

　2.ES细胞具有以下特性：①全能性。ES细胞具有能发育为构成机体的任何一种不同细胞类型的潜力；②无限扩增。ES细胞在体外适宜条件下，能在未分化状态下无限增殖，这为ES细胞的研究和应用提供了用之不竭的细胞来源。③可操作性。

　　3.胚胎干细胞向神经干细胞分化：最近有学者将小鼠ES细胞置于仅含成纤维生长因子-2（FGF-2）的培养基中增殖，然后加入血小板生长因子（PDGF），在两者的混合液体培养中，这些多能细胞维持多代而不分化，得到表达神经胶质前体标志分子的纯的多能祖细胞。当除去FGF-2和PDGF后，这些细胞最终只向着少突神经胶质细胞或星形神经胶质细胞分化。Vogel等将人ES细胞培养至拟胚体（EBs）后，用神经细胞培养基（常规培养神经细胞的培养基）培养，分离出部分分化的EBs在含碱性成纤维生长因子（bFGF)的培养基中培养，最终获得96%表达神经元标志的细胞。这是一种将人ES细胞定向分化为神经上皮细胞的有效方法。

　刘登华等以原代培养的方法，分别从昆明胎鼠和人流胎儿组织中分离培养小鼠胚胎成纤维细胞（MEF，mouse embryonic fibriblast)及人胚胎成纤维细胞（HEF， human emmbryonic fibriblast).结果显示HEF能有效支持囊胚及胚胎干细胞的生长，且优于MEF。（2）利用微滴培养技术，采用囊胚培养法，从孕3.5天昆明小鼠子宫中冲得胚胎，分别置于不同条件下进行培养。再通过显微操作，用机械分离和酶消化相结合的方法，进行内细胞团（ICM，inner cell mass)的传代，进而分离得不偿失到胚胎干细胞（ES cell,embryonic stem cell),并传至第9代。AKP（碱性磷酸酶）染色、SSEA-1（阶段特异性胚胎抗原-1）染色阳性显示其其未分化状态。利用WK1-ES细胞系，采用5×10-7M的维甲酸，通过传统的4-/4+方法，定向诱导胚胎干细胞分化为神经样细胞。并采用免疫细胞化学进行Neun(神经元特异核抗原）染色鉴定。

　4.胚胎干细胞与神经干细胞比较，胚胎干细胞有形成畸胎瘤的倾向，还必须对胚胎干细胞及其衍生细胞的移植的安全性做一全面、客观、深入的评价。

　 5.将胚胎干细胞在体外培养成神经干细胞，然后再移植入宿主脑内，可能用于治疗脑血管疾病。目前胚胎干细胞治疗神经系统变性疾病与帕森病的动物实验及临床实验均有报道，但关于脑血管的动物实验及临床实验还未见报道。

　6.存在问题
　　目前已有的ES细胞株由于存在免疫相容性问题，不一定适用与所有患者。未分化的ES细胞移植入体内易形成畸胎瘤。在移植前须分化成特定的细胞类型，这些诱导出的细胞移植后是否具有真正的功能（功能性分化的问题）目前尚不确定。

　干细胞治疗脑血管疾病存在的伦理问题

　骨髓间充质干细胞如果自体移植就可以回避伦理问题，胚胎干细胞及神经干细胞的来源主要有胚胎和克隆两个方面，而这两个方面均涉及到一定的伦理问题。

　随着科学技术的进步，干细胞的基础研究与临床应用会进一步提高，相信会使脑血管疾病的治疗得到根本的改变。