脑出血患者血肿周围组织炎性反应与细胞凋亡的相关性研究

【摘要】目的探讨脑出血患者血肿周围组织炎性反应与细胞凋亡的关系。方法对30例手术的脑出血患者于血肿旁约1 cm处取少许脑组织作为试验组，按发病到手术的时间将试验组分为<6 h(6例)、6~12 h(7例)、12~24 h(5例)、24~72 h(6例)、>72 h(6例)。从前两组中选7例患者于手术入颅路径上远隔血肿处取少许脑组织作为对照组。应用苏木素-伊红(HE)染色、免疫组化染色、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）分别观察组织病理、炎性细胞浸润和小胶质细胞增生、凋亡细胞、促凋亡基因(Bax)、抗凋亡基因(Bcl-x)的变化情况。结果光镜观察显示:对照组和试验组6 h内脑组织基本正常，试验组6~12 h损伤较轻，12~24 h损伤较重，24~48 h损伤严重，以后逐渐好转，8 d时与对照组相似。免疫组化显示:中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞浸润从6~12 h逐渐明显，12~24 h达高峰(P均<0.01)，小胶质细胞增生从24~72 h开始，72 h以后明显增强(P均<0.01)；凋亡细胞、Bax蛋白表达从6~12 h开始增加，12~24 h达高峰(P<0.05或P<0.01)，Bcl-x蛋白及其mRNA表达从12~72 h有增加的趋势，但差异无显著性。RT-PCR显示:Bax mRNA表达与免疫组化结果相似;相关分析显示:中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞浸润和小胶质细胞增生与凋亡细胞、Bax蛋白和Bax mRNA表达呈显著正相关(P<0.05或P<0.01)，与Bcl-x蛋白及其mRNA表达无相关性(P均>0.05)。结论脑出血后血肿周围组织的炎性反应与细胞凋亡关系密切，并与组织病理损伤相一致。
【关键词】脑出血；血肿周围组织；炎性反应；细胞凋亡

Study of relationship between inflammatory response and apoptosis in perihematoma region in patients with intracerebral hemorrhage GUO Fu-qiang, LI Xiao-jia, CHEN Long-yi, YANG Hong, DAI Hong-yuan, WEI Yong-sheng, HUANG Yu-lan,YANG You-song, SUN Hong-bin, XU Yu-chuan, YANG Zheng-lin.Department of Neurology, Sichuan Provincial People′s Hospital, Chengdu 610072, Sichuan, China
OBJECTIVE: To investigate the relationship between inflammatory response and cell apoptosis in the perihematoma region in patients with intracerebral hemorrhage (ICH). METHODS: Surgical specimens were obtained from the area 1 cm adjacent to the hematoma. Thirty patients with ICH were divided into five groups: 6, 7, 5, 6, 6 patients in surgery＜6 hours, 6-12 hours, 12-24 hours, 24-72 hours and >72 hours groups after the onset, respectively. The control group specimens were obtained from the brain tissues distant to the hematoma in the process of craniotomy in the patients of two former groups. Sections were stained with hematoxylin and eosin (HE) for the examination of pathological changes. Immunohistochemistry, terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP biotin nick end labeling (TUNEL) and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) were applied to determine apoptosis cells, Bax and Bcl-x protein and mRNA. RESULTS: The tissues from perihematoma region were almost normal in control group and ＜6 hours group. They were slightly damaged in 6-12 hours group,became worse in 12-24 hours group and most severe in 24-48 hours group, and they became better latter and were similar to the control group on 8 th day. Infiltration of neutrophils, macrophages and lymphocyte appeared gradually at 6-12 hours, and became much more prominent at 12-24 hours (all P<0.01). The reactive gliosis began to appear at 24-72 hours, and enhanced after 72 hours (all P<0.01). The expression of the apoptosis and Bax protein increased gradually after 6 hours, reaching the peak at 12-24 hours (P<0.05 or P<0.01), and decreased gradually later. The changes in the levels of Bax mRNA were similar to that of the result of immunohistochemistry. Although the expression of Bcl-x protein and mRNA seemed to be increased at 12-72 hours, there was no significant difference between groups(P>0.05).The correlation analysis showed that the infiltration of neutrophils, macrophages and lymphocyte was positively correlated to the TUNEL positive cells and expression of Bax protein and mRNA (P<0.05 or P<0.01), and showed no correlation to Bcl-x proteinand mRNA (all P>0.05). CONCLUSION: There is a close relationship between inflammatory response and apoptosis and tissue damage in the perihematoma area in ICH
【Key words】 intracerebral hemorrhage; perihematoma; inflammation; apoptosis

动物研究发现，脑出血血肿周围组织存在明显炎性反应并伴随细胞凋亡和死亡，并认为是脑出血后继发性脑损伤的主要形式之一(1)。关于人脑出血后血肿周围组织的这些变化甚少报道。本研究中拟观察脑出血患者血肿周围组织的这些变化，探讨炎症反应与细胞凋亡之间的关系，报告如下。
1 资料与方法
1.1 标本采集：选择本院2003年1月—2005年1月行直视开颅手术的脑出血患者，其中男21例，女9例；年龄23~76岁，平均55.3岁；高血压脑出血26例，非高血压脑出血4例；基底节出血25例，脑叶出血3例，小脑出血2例；血肿大小为40~70 ml(小脑出血患者>10 ml)。手术均采用非功能区入颅方式,在清除血肿前均于血肿旁约1 cm处取少许脑组织作为试验组；于入颅路径上远离血肿处取少许脑组织作为对照组。所有患者及家属术前均签署知情同书。
12 病例分组：试验组30例，按发病至手术时间分为<6 h(6例)、6~12 h(7例)、12~24 h(5例)、24~72 h(6例)、>72 h(6例)5个亚组。对照组7例为发病≤12 h的患者，其中基底节出血5例，脑叶出血1例，小脑出血1例。病理学观察标本即刻置于体积分数为4%的多聚甲醛磷酸盐缓冲液(PBS)中固定；逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测标本置于无菌盒中，迅速放于-70 ℃的冰箱中待查。
1.3 病理学观察：标本置于4%多聚甲醛PBS中固定，石蜡包埋，切片机上切片，行苏木素-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察脑组织病理形态的变化。
1.4 免疫组化及细胞凋亡检测：用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测凋亡细胞；
用免疫组化LDP法观察Bax、Bcl-x、CD45、CD68和神经胶质元纤维酸性蛋白(GFAP)。上述检测方法均严格按各自试剂盒说明书操作进行。Bax、Bcl-x分别代表促凋亡基因蛋白和抗凋亡基因蛋白；CD45标记中性粒细胞、淋巴细胞；CD68标记巨噬细胞；GFAP标记小胶质细胞。TUNEL结果评定：显微镜下测量10个高倍视野(×400)中神经细胞及神经胶质细胞阳性数，TUNEL换算成标记指数阳性细胞数/测量细胞核总数×100%)。Bax、Bcl-x、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、小胶质细胞阳性表达结果为细胞胞质或胞核呈棕黄色，在显微镜下分别测量10个不重复的独立高倍视野（×400）中阳性表达细胞数，取平均值。
1.5 RT-PCR检测Bax和Bcl-x的mRNA表达：以β-肌动蛋白(β-actin)为内参对照行半定量分析。各引物PCR产物片段大小及序列：β-actin（184 bp）：上游5′-caactccatcatgaagtgtgac-3′,下游5′-ccacacggagtacttgcgctc-3′；Bax(139　bp):上游5′-gctgttgggctggatccaag-3′,下游5′-tcagcccatcttcttcaga-3′；Bcl-x(140　bp):上游5′-ggaacaatgcagcagccgag-3′,下游5′-gtagagtggatggtcgtgt-3′。组织中总RNA提取和两步RT-PCR方法操作按Trizol说明书进行。两步RT-PCR检测 mRNA的表达：①逆转录：按TakaRa RNA PCR Kit(Amv)Ver 3.0说明书将总RNA逆转录为cDNA,逆转录反应体系为10 μl，程序如下：30 ℃10 min，42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。②扩增：逆转录反应体系为50 μl，程序如下：94 ℃ 5 min预处理，94 ℃ 30 s变性；β-actin 58 ℃、Bax 59 ℃、Bcl-x 56 ℃均45 s退火；72 ℃ 55 s延伸；72 ℃ 7 min末次延伸。β-actin循环28次，Bax循环36次，Bcl-x循环32次。③检测：取扩增产物5 μl，加入5 μl上样缓冲液(Loading Buffer)后上样于质量分数为15%的琼脂糖凝胶，加DNA Marker同步电泳35 min(5 Ｖ/cm)，溴化乙锭染色。采用Quality one凝胶成像分析系统扫描PCR产物量，以相对吸光度(ROD)×面积（mm）表示，分析结果以β-actin为对照。
1.6 统计学分析：采用SPSS 10.2软件分别进行统计学分析。数据以均数±标准差(x[TX-]±s)表示，行单因素方差分析及直线相关分析，相关系数用Pearson相关系数表示，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 脑出血血肿周围组织病理变化:对照组脑组织染色正常,细胞结构完整、数目未见减少；无核固缩现象及炎性细胞浸润。发病6 h内，脑组织病理改变与对照组相似，偶见炎性细胞浸润。发病6~12 h，脑组织轻度损伤，偶见细胞及间质水肿；少数细胞形态不完整，偶见细胞核固缩；有散在炎性细胞浸润。发病12~24 h，脑组织损伤较重，细胞和间质轻度水肿；部分细胞形态散在不完整，神经元散在、呈三角形，核固缩；炎性细胞浸润明显。发病24~48 h，脑组织损伤最重，细胞及间质水肿明显，细胞形态不完整较多，较多神经元呈三角形和核固缩；炎性细胞浸润明显。发病48~72 h，脑组织损伤较重，病理改变与发病12~24 h相似。脑出血5 d时，脑组织病理改变与6~12 h接近，其损伤已有好转，可见胶质细胞增生。脑出血8 d时，脑组织病理改变与发病
6 h内相近，病理损伤明显好转，可见到较多胶质细胞增生。
2.2 脑出血血肿周围组织炎性反应与细胞凋亡的动态变化（表1,彩色插页图1A~L）2.2.1 炎性细胞浸润和胶质细胞增生(表1)：观察CD45、CD68、GFAP免疫组化染色，光镜下对照组基本上未见中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞浸润；发病6~12 h可见少许中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞浸润，而小胶质细胞增生不明显；12~24 h中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞浸润达高峰（P均<0.01），小胶质细胞增生开始明显；到24~72 h炎性细胞浸润逐渐减轻，而小胶质细胞增生达高峰，72 h以后小胶质细胞增生仍明显（P均<0.01）。
2.2.2 细胞凋亡(表1)：TUNEL阳性细胞表达数从6~12 h开始增加,12~24 h达高峰(P<0.05或P<0.01)，72 h以后逐渐下降。
2.2.3 蛋白与基因表达(表1，图2)：Bax蛋白及其mRNA表达于6~12 h开始上调，12~24 h达高峰(P<0.05或P<0.01)，72 h后开始下降。而Bcl-x蛋白及其mRNA表达在12~72 h有增加趋势，但差异均无显著性(P均>0.05)。
2.3 血肿周围组织炎性反应与细胞凋亡的相关性（表2）：中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞的浸润数量和小胶质细胞反应性增生数量与凋亡细胞、Bax蛋白和Bax mRNA的表达呈显著正相关(P<0.05或P<0.01)，与Bcl-x蛋白及其mRNA表达无相关性
3 讨论
脑出血后血肿周围组织存在着继发性病理损伤(1-5)。本研究发现，脑出血6 h内，血肿周围组织结构与对照组基本相似，无明显损害；6~12 h开始出现轻微损伤，12~24 h损伤达高峰，后逐渐减轻，8 d基本与对照组接近，这一动态结果进一步说明了脑出血后血肿周围组织存在继发性损伤，但机制迄今仍不完全清楚。目前的研究提示，其可能与缺血性损伤(3，6)以及炎性反应介导的免疫损伤(1，3，4)、脑水肿(7)、凝血酶级联反应(8)、细胞凋亡(1,9,10)有关。Xue等(1，11)研究发现，大鼠脑出血后48~72 h血肿周围组织炎性反应最明显，中性粒细胞浸润于48 h达高峰；淋巴细胞于48 h开始浸润，持续1周；巨噬细胞反应在48~72 h达峰，持续时间更长；小胶质细胞、星形胶质细胞6 h内即有增生，48~72 h最明显；在炎性反应最明显的48~72 h伴有明显的神经细胞凋亡；巨噬细胞的反应与凋亡细胞存在时间一致性。Matsushita等(12)在大鼠脑出血的实验中也得到相似的结果。廖维宏等(13)研究表明，脑损伤后出现了细胞凋亡。Qureshi等(5)在12例脑出血患者血肿样本中也检测到了明显的凋亡细胞。本研究还发现，脑出血后6 h内，血肿内仅有少量中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和小胶质细胞浸润，6~12 h以后浸润明显增加，12~24 h中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞达高峰，72 h后明显减轻，而小胶质细胞的增生反应于24~72 h达高峰，72 h以后仍明显。细胞凋亡和促凋亡基因Bax蛋白及其mRNA的表达从6~12 h开始增加，12~24 h最明显；而抗凋亡基因Bcl-x蛋白及其mRNA表达在12~24 h有增高趋势，但差异无显著性。Bcl-x与Bax表达不同步上调是否就是动物与人的不同，还有待进一步研究。上述研究结果提示，脑出血患者血肿周围组织存在明显的炎症反应过程，这与伴随的凋亡细胞产生和促凋亡基因表达增加之间可能存在相关性。此外，小胶质细胞增生在72 h后仍明显,也许在脑损害与脑保护上存在双重作用，还有待进一步研究。炎性细胞的浸润可能通过以下3个途径引起脑损伤：①大量炎性细胞浸润于血肿周围脑组织的微循环，导致微循环阻塞和继发性缺血、缺氧，产生大量自由基，激活自由基连锁反应，引起脑损伤(14)；②大量炎性细胞浸润，胶质细胞反应增生，分泌和释放大量细胞因子，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、γ-干扰素（IFNγ）等，可诱导细胞凋亡(1，11)；③炎性反应能激活补体 C3、C5等，引起脑细胞水肿，加重脑损伤(4)。Mayne 等(15)研究发现，浸润的中性粒细胞能释放TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ等细胞因子，加重脑损伤。此外，淋巴细胞还可释放IFN-γ；巨噬细胞还可分泌TNF-α，并可发挥吞噬作用，造成神经细胞损伤；小胶质细胞、星形胶质细胞可分泌IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性细胞因子，造成细胞损伤；小胶质细胞和巨噬细胞还有吞噬细胞的功能，造成神经细胞直接损伤(4)。Holmin等(16)给大鼠脑内注入IL-1β和TNF-α后24 h，发现诱导出凋亡细胞，且这些凋亡细胞均表达促凋亡基因Bax。而Mayne 等(15)在大鼠脑出血后发现，中性粒细胞、巨噬细胞、小胶质细胞表达TNF-α增加，用TNF-α拮抗剂后，凋亡细胞数目明显减少。本研究结果提示，脑出血后血肿周围组织炎性反应与继发性损伤有关，如能恰当及时地阻止炎性细胞浸润和胶质细胞反应性增生，对减轻血肿周围组织的继发性损伤是有益的。

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作者单位：610072 成都，四川省人民医院神经内科（郭富强，李晓佳,代红源,韦永胜,黄雨兰,杨友松,孙红斌），神经外科（陈隆益），病理科（杨红，徐玉川）；人类遗传疾病与基因研究中心，美国犹他大学分子生物学与遗传研究中心(YANG Zhenglin)
作者简介：郭富强(1960-)，男(汉族)，四川成都人，硕士研究生导师，主任医师，主要从事脑血管病的研究。